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MANUAL PARA GERMINAÇÃO IN VITRO DE ORQUIDEAS

Dra. Sheena McKendrick

© Copyright 2000, Fundação Ceiba para Conservação Tropical

Março 2000

O manual seguinte inclui a biologia básica para a germinação de sementes de orquídeas, algumas técnicas usadas para a germinação de orquídeas com ajuda da técnica em vitro, e um apêndice dos meios e espécies experimentados dentro do programa de germinação em vitro na Reserva Orquideológica O Pahuma. O manual

foi desenhado especificamente para o Programa Orquideologico de O Pahuma, porém pode adaptar-se a outros programas.

RECONHECIMENTOS

Agradecimento especial para Nelson Zabala e para a Universidade São Francisco de Quito por permitir a Ceiba para fazer uso dos seus equipamentos para levar a cabo o programa de germinação em vitro. Nós também agradecemos Margaret Ramsay de Jardins Botânicos Reais, Kew, Inglaterra, pela sua util coleção de notas sobre propagação de orquídeas, e para Robert Mitchell e Grace Prendergast, também de Kew, por ter me ensinado estas técnicas. Igualmente eu quero estender meu agradecimento a Dick Warren da Companhia de Planta Equatorial, David Menzies de Glasgow Botanic Gardens e a Mónica de Navarro da Sociedade Orquideológica de Quito por toda sua ajuda e seus conselhos. Também agradeço a Lorena Gamboa de Rainforest Rescue que fez a tradução deste manual para espanhol. Por ultimo, quero agradecer de um modo especial a Família Lima que com o grande desejo em conservar a floresta tornou possível que este projeto fosse realizado.

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ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO

    1. propósitos do Programa de Germinação Em Vitro em O Pahuma
    2. A biologia da germinação de sementes de orquídeas

1.3 Fundações da germinação em vitro

1.3.1 germinação de Sementes Simbióticas e não Simbióticas

1.3.2 Bases para manter as condições de esterilização

1.3.3 Uso da câmara de fluxo laminar

2. PREPARAÇÃO DOS MEIOS

2.1 introdução para a preparação dos meios

2.2 metodologia geral para a preparação dos meios

2.3 transferência dos Meios

3. SEMEADURA DAS SEMENTES

3.1 Coleta e armazenamento das sementes

3.2 Semeadura das sementes

3.2.1 cápsulas verdes vs. cápsulas maduras

3.2.2 disseminação a partir de cápsulas verdes

3.2.3 disseminação a partir de cápsulas maduras

3.2.3.1 método da Seringa

3.2.3.2 método do Pacote (ou fundo de papel)

3.3 cobertura dos recipientes

3.4 manutenção de registros

4 CUIDADO DAS PLANTULAS

4.1 As plántulas nos frascos

4.2 Transplante

5 CONCLUSÃO

6 BIBLIOGRAFIA

7 APENDICES

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1. INTRODUÇÃO

1.1 propósitos do Programa de Germinação Em Vitro em O Pahuma

A germinação em vitro de sementes de orquídeas é um componente importante do programa de conservação da Fundação Ceiba para a Conservação Tropical na Reserva Orquideológica O Pahuma, a Noroeste de Quito,Equador.

Os objetivos deste programa de propagação em vitro são os seguintes:

1. Cultivar orquídeas para o Jardim Botânico O Pahuma.

2. Reproduzir espécies raras e únicas de orquídeas para aumentar tanto o numero nos meios naturais da Reserva como em lugares fora dela (como jardins botânicos, programa de conservação, entre outro), e para

prover sementes a programas de restauração e regeneração de florestas.

3. Prover sementes para a venda na Reserva como um meio para parar a coleção de espécimes silvestres, estimular o interesse público e coletar, rendas para o desenvolvimento da Reserva e outros programas de

conservação de orquídeas.

4. Cultivar sementes de espécies sem igual ou ornamentais para a exportação em frascos com o propósito de apoiar a conservação empreendido na Reserva Orquideológica O Pahuma.

Toda receita que vêm da venda de espécies de orquídeas, tanto em O Pahuma como por meio da exportação, eles serão reinvestidos na Reserva e em outros projetos de conservação.

1.2 A biologia da germinação de sementes de orquídeas

As sementes de orquídeas são normalmente conhecidas como sementes em pó porque elas são minúsculas e elas contêm poucas reservas de alimento. Estas sementes normalmente não germinam nos meios naturais a menos que eles sejam infetados por um fungo micorriza, o mesmo que abastecem as plantas jovens com açúcares e nutrientes que eles precisam até que eles são o suficientemente grande para fabricar seu próprio alimento.

Quando a semente germina produz uma massa indiferenciada de células chamados protocornio (figura 1). Mantendo as condições normais, o protocornio continuarão seu crescimento durante várias semanas, meses ou até mesmo anos dependendo das espécies até que alcança a idade apropriada para produzir raízes e folhas. No caso de orquídeas terrestres, é de importância vital que a relação orquídea-fungo se conserve durante os estados do ciclo de vida da planta no qual o protocornio enterrado não pode fabricar alimento por si mesmo. Por outro lado, o protocornios de orquídeas epífitas é geralmente verde, o que os facilita produzir parte, de seu alimento. A relação orquídea-fungo não esteve em sua totalidade investigado para o caso das orquídeas tropicais.

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1.3 Fundamentos da Germinação Em Vitro

1.3.1 germinação Simbiótica e não Simbiótica de Sementes

Por meio da germinação em vitro, se reproduzem sementes em frascos de vidro ou plástico sobre um meio de ágar nutritivo que contém os açúcares e minerais necessário de forma que as sementes germinem e cresçam. Há dois tipos básicos de germinação em vitro: simbiótica e não simbiótica.

Na germinação simbiótica, as sementes se semeiam com uma porção pequena de fungo micorriza apropriado. O fungo cresce nos meios, coloniza às sementes em processo de germinação e se origina uma relação simbiótica que se espera alimenta ao protocornio até produzir folhas e se tornar autotrófico. Esta técnica é amplamente usada para propagação de orquídeas terrestres em áreas temperadas.

Tem a vantagem de usar um meio simples (um dos mais geralmente usados consiste em aveia em pó com uma quantidade pequena de extrato de levedura), e como resultado das plantas micorrizadas são normalmente mais fortes e mais resistentes a infecções que as cultivadas asimbióticamente.

Porém, a desvantagem é que se precisa selecionar o tipo de fungo micorriza apropriado para que se origine a simbiose e prevenir o parasitismo e a morte conseqüente das sementes.

Existe pequena investigação na relação do micorriza em forma de fungo com as orquídeas tropicais, e portanto não se dispõe do fungo micorriza apropriado.

A germinação asimbiótica é normalmente usado na propagação de orquídeas tropicais, as mesmas que tendem a crescer facilmente em comparação com suas parentes em áreas temperadas.

Os meios usados para o germinação asimbiótica é mais complexo que para a germinação simbiótica

Já que todos os nutrientes, orgânico e inorgânico e os açúcares devem estar disponíveis para a orquídea em uma forma apropriada já que não existe intermediação do fungo.

A germinação asimbiótica é um método usado no momento no programa de germinação em vitro na Reserva Orquideológica O Pahuma.

No caso de se dispor do fungo a partir de semeaduras em situ, haveria a possibilidade usar técnicas simbióticas no futuro.

1.3.2 Fundamentos para manter condições de esterilização

Tanto para a germinação simbiótica e asimbiótica é de importância vital que os meios, os frascos, os aparatos e as sementes se mantenham desinfetados desde o inicio do processo de germinação. Qualquer bactéria ou fungo que introduzido nos frascos crescerá mais rápido que as sementes e logo vai ocupar o espaço delas até as matar.

As condições de esterilização na preparação do meio se criam autoclavando o meio e os frascos a serem utilizados por 15 minutos a 15 atm.

Esta temperatura e pressão são bastante para matar todos os esporos de bactérias e fungos presentes nos meios.

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As sementes devem ser esterilizadas e ser transferidas aos frascos sem introduzir fungos ou bactérias externas. Geralmente, este processo se realiza semeando desde a superfície desinfetada de cápsulas verdes, ou desinfetando sementes maduras com hypochlorito de sódio ou cálcio, ou peroxido de hidrogênio.

Temos de ter certeza que estão desinfetados todos os instrumentos usados na transferência.

Com certo cuidado e pratica se pode criar e manter condições de esterilização desde a germinação até o transplante das sementes.

No programa de germinação para O Pahuma, a esterilização consiste em esvaziar os meios e semear as sementes em uma câmara de fluxo laminar.

Outras técnicas para manter estas condições de esterilização são possíveis ( Thompson 1980), porém eles são complicados tecnicamente e não devem ser desenvolvido em condições úmidas e sem limpeza apropriada.

1.3.3 uso da câmara de fluxo laminar

Deve-se prestar atenção a certas regras básicas ao usar a câmara de fluxo laminar:

  1. Sempre se deve desinfetar por completo usando álcool de 70-90 % (de preferência Etanol, ter muito cuidado se utiliza álcool anti-séptico que também contém metanol. O metanol é tóxico e pode causar cegueira se ingerido). Use um roceador e limpe todas as superfícies da câmara com um algodão encharcado de álcool (inclusive as paredes e o teto).

Deve ser desinfetado tanto antes como depois de usar a câmara . Tenha o cuidado de não inalar quando se passe o etanol para usar a câmara .

Tudo que entrará na câmara deve ser esterilizado. Use luvas e os desinfete completamente antes de usar, passando álcool e os mantendo na câmara até que o álcool seque. Com prática, é possível no lugar de usar luvas, lavar as mãos e esfregar as unhas usando um sabão antibacteriano, secar e esterilizar com álcool, porém no caso de existirem problemas com contaminação bacteriana usar as luvas novamente. Use um avental de laboratório e lave-o constantemente.

Tenha certeza que os frascos de vidro estejam limpos. Os frascos de vidro podem ser roceados com álcool ao introduzi-los na câmara , mas com precaução. Qualquer nota escrita com marcador no vidro será apagada pelo etanol. Se os frascos estão limpos, rocearlos com etanol não serão necessários. Esses instrumentos podem ser autoclavados antes do seu uso, embrulhando-os previamente em papel de alumínio ou papel de empacotar café fechado com fita adesiva. Uma vez na câmara , a esterilização é assegurada submergindo em etanol 100% e incendiando-a três vezes antes de usar. O melhor modo para conservar o etanol está em frascos grandes de vidro para permitir a máxima exposição dos instrumentos ao etanol. Depois de Flambar os instrumentos estes devem ser colocados depressa em um frasco de vidro esterilizado para continuar com o flameado. Deixe-os esfriar antes do uso.

  1. Se lembre que qualquer esporo de bactéria ou fungo dentro da câmara flutuará para o interior e em direção a sua pessoa. Nunca ponha as mãos, mangas ou outro objeto sobre ou em direção de algo desinfetado (como os meios).
  2. Mantenha movimentos leves e evite criar turbulência de ar que possa causar contaminação.

    Não fale, tussa ou espirre dentro da câmara . Trabalhe no possível pela parte de atrás da câmara e minimize o tempo de exibição dos meios quanto possível.

    3 Mantenha as condições de esterilização por meio da limpeza regular da câmara com álcool, desinfete os instrumentos novamente depois do seu uso e lave as mãos novamente depois de ter tido contato com qualquer objeto fora da câmara .

    De um modo especial, não toque no cabelo ou na face com as luvas colocadas.

    ADVERTÊNCIAS DE PRECAUÇÃO

    1. Tenha cuidado para não QUEIMAR suas MÃOS - particularmente quando usa luvas! É fácil de fazer isto pois você não pode sentir se o álcool das luvas evaporaram completamente. Vantajosamente o etanol queima em baixa temperatura e podem ser facilmente evaporado quando agitado com força.

  3. Tenha cuidado para não QUEIMAR - ou queimar as sementes que você esta transferindo de um lugar para outro - os instrumentos a ser usados se esquentam altamente depois de duas .

3. SEMPRE SE LEMBRE DE FEICHAR O GAS - tanto no isqueiro de fogo como na parte superior do cilindro de gás.

2 PREPARAÇÃO DOS MEIOS

2.1 introdução para a Preparação dos Meios

Os meios podem ser preparados usando ingredientes básicos (Thompson,1977, apêndice 1) ou comprar em pó dos fornecedores. Há diferente tipos de meios disponíveis para a venda como também outros específicos para certas espécies projetadas por peritos profissionais. Quando se inicia o processo de germinação de uma nova espécie é aconselhável provar com diferentes meios para uma concentração total e parcial para determinar qual é o melhor meio para esta espécie. Por exemplo, o gênero Masdevallias é conhecido como um gênero "escolhedor" dos meios em qual desenvolverá (Richard Warren, conversação pessoal). O nível de pH também é importante. A maioria de orquídeas germina dentro de um meio de pH 5.5 porem, espécies andinas preferem níveis mais altos de pH, 5.6 ao 5.9 (Mónica de Navarro, conversação pessoal). Ao experimentar com o pH se deve considerar que o pH dos meios será mais alto somando o ágar que antes de fazê-lo.

As preparações comerciais de Phytamax (Sigma Química, Aldrich, Inglaterra) e

Murashige e Skoog foram os meios principais usados no projeto de O Pahuma (março de 2000).

Qualquer um destes meios pode estar tanto preparado para uma concentração parcial ou total (a concentração parcial é recomendada para Murashige e Skoog).

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O método geral para a preparação destes meios é o que é detalhado a seguir.

2.2 método geral para a preparação dos meios

  1. Medir a quantidade correta do meio em pó usando uma garrafa de 1 litro e evitando o contato com o pó da atmosfera.

2. Só para Murashige e Skoog: somar a quantidade correta de açúcar e 2gr/l de carvão ativado.

3. Somar uma barra magnética e uma pequena quantidade de água destilada e misturar até que se dissolva.

4. Encher o recipiente com água destilada até obter 1 litro e agitar continuamente.

  1. Medir o pH e ajusta-lo a 5.6 usando HCl ou NaOH e misturando completamente com a barra magnética.

* Precaução: se estiver usando um medidor de pH não se deve misturar o meio quando se encontra dentro o pHmetro: a membrana é muito delicada e cara e pode quebrar facilmente. Se não temos o medidor de pH, os papeis indicadores de pH são suficientes.

6. Verter a metade do líquido em um frasco, acrescentar 4 gramas de ágar a cada recipiente (8 gr/l de ágar) e misturar para que se disperse.

7. Fechar a tampa da garrafa sem apertar totalmente, cobrir os frascos com papel alumínio e os levar ao autoclave.

Em condições ideais os meios devem ser preparados em uma garrafa com a barra magnético durante todo processo de autoclave inteiro com o propósito de que o meio seja misturado antes de vertê-lo nos frascos, alcançando uma distribuição melhor do carvão ativado no mesmo. Porém, por razões de segurança a Universidade prefere usar duas garrafas ou frascos de 500 ml deste modo para manter a barra magnética na garrafa e agitar suavemente antes de verter para dispersar o carvão ativado.

ADVERTÊNCIAS DE PRECAUÇÃO

  1. NÃO RESPIRE O PHYTAMAX EM PÓ E EVITE O CONTATO COM A PELE E OS OLHOS.
  2. Se você tiver contato com o pó do Phytamax, Murashige, e Skoog, ou o carvão ativado, deverá lavar imediatamente a parte afetada com bastante água fria. Se tiver contato com os olhos, lave-os imediatamente com água fria e solicite cuidado clínico.

  3. NUNCA FECHE HERMETICAMENTE A TAMPA DO FRASCO OU GARRAFA ANTES DE COLOCA-LA NA AUTOCLAVE.

O elevado aumento de pressão na autoclave causará explosão do frasco ou garrafa. Sempre tenha certeza que as tampas estão frouxas ao colocar os frascos na autoclave: só podem fechar eles fortemente depois dos frascos esfriarem.

3. TENHA CUIDADO AO TIRAR OS FRASCOS E GARRAFAS DA AUTOCLAVE.

Eles estarão bastante quentes e você pode sofrer queimaduras.

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2.3 Transferência dos Meios (colocar nos frascos)

Verter os meios nos frascos ou caixas Petri esterilizadas, deve-se usar a câmara de fluxo laminar (veja item 1.2.3). Os frascos devem ser ensaboados e lavados completamente quatro vezes antes de usar, e desinfetado por 15 minutos a 15 Psi. na autoclave. Se temos frascos com tampa se lembre de fecha-las totalmente antes de coloca-los na autoclave. Se a pessoa não tiver tampas disponíveis, pode cobrir os frascos com um pedaço de papel alumínio. Você também pode usar papel de empacotar café fechado com um barbante, mas é mais inadequado. Deve-se repetir a esterilização dos frascos que saem da autoclave com papel alumínio ou sem o papel de alumínio.

1. Espere os meios esfriarem bastante para pegar com as mãos. Quando o ágar esta menos líquido e a garrafa ou frasco não está tão quente, pode-se derramar nos meios.

Se derramar o ágar muito quente pode-se causar uma condensação alta.

  1. Ponha em linha os frascos ou caixas Petri começando do fundo da câmara de fluxo laminar, soltando o tampas dos frascos.
  2. Tire as tampas dos frascos ou caixas Petri e verta o ágar movendo da esquerda para direita (se és destro) para evitar que qualquer parte da mão ou do avental de laboratório toque em um frasco ou caixa aberta.
  3. Deixe que se assente o meio e ponha as tampas novamente. Pode se cobrir esses frascos imediatamente depois que derramou o meio, mas a pessoa pode causar condensação.

A água disponível nos frascos pode ou não ser útil dependendo da maturidade das sementes.

A preparação completa do meio desde a mistura dos ingredientes até o estabelecimento do meio vertido tem um tempo estimado de 4 horas de duração.

Se foi preparado 2 litros prontos de meio você pode usar uma estufa para manter uma garrafa quente até terminar de usar a outra. A estufa quente só deve ser usado por pouco tempo (emergências), e no caso de períodos mais prolongados (como uma meia hora) se provocara a precipitação do carvão ativado.

3. SEMEADURA DAS SEMENTES

3.1 Coleta e Armazenamento das Sementes

As sementes podem ser coletadas a partir de cápsulas verdes ou cápsulas maduras.

Uma cápsula verde que está amadurecendo, e esta pronta para ser semeado, está cheio com sementes e não se deforma quando se aperta com as pinças," está intato." As cápsulas podem ser armazenadas por algumas semanas se envolvidas em papel de cozinha e se os coloca num lugar do refrigerador com bastante aeração (como o compartimento para o queijo). Não se deve armazenar as sementes em potes de plástico pois as cápsulas suarão e serão apodrecidas.

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Se for possível, é melhor coletar cápsulas que foram expostas a um dia seco. É aconselhável usar sementes frescas ou secas numa solução saturada de hexahidrato de cálcio (Seaton & Pitchard, 19xx). Se este composto não esta à disposição, pode-se secar com cloreto de cálcio, gel de sílica, (mais áspero que o cloreto de cálcio e somente recomendado usar a curto prazo) ou simplesmente secar a temperatura ambiente em um quarto (só em climas secos). Uma vez as sementes estão secas, pode-se armazenar por muitos meses em frascos fechados dentro de um refrigerador (4-5C).

Novamente, as sementes nunca devem ser armazenadas ou transportadas em potes de plástico ou recipientes com ar dentro.

O tempo desde o florescimento até a maturação das sementes varia significativamente de acordo com as espécies e o lugar. Por exemplo, as sementes de Epidendrum ou Masdevallia requerem aproximadamente de 3.5 meses para amadurecer enquanto as sementes de Odontoglossum requerem ao redor de 18 meses (Mónica de Navarro, conversação pessoal).

As estimativas convencionais não levam em conta as diferenças climáticas; na realidade uma cápsula que cresce em um recipiente de vidro quente vai amadurecer muito mais rápido do que aquele crescendo na floresta nublada. Todas as plantas coletadas na Reserva Orquideológica O Pahuma deve ser marcado com uma fita adesiva e registrada com um código, e lembrando-se de incluir este número nos detalhes do semeadura.

3.2 Semeadura das Sementes

3.2.1 Cápsulas verdes vs. sementes secas

Você pode semear sementes a partir de cápsulas verdes ou a partir de sementes secas. Logo são descritas as vantagens e desvantagens de ambos os métodos:

  1. Semeadura a partir de cápsulas verdes. O interior das cápsulas de orquídeas permanece estéril se as cápsulas estão intatas. Então, se a parte externa da mesma é esterilizado, onde fungos e bactérias podem ser desenvolvidas, e abre-se as cápsulas debaixo de condições de esterilização as sementes poderão manter-se desinfetadas. A vantagem deste método é que não se requer a esterilização das sementes, o que poderia causar sua deterioração. Também, algumas sementes tomadas de cápsulas quase maduras poderiam germinar mais rapidamente que as vindo de cápsulas maduras por causa dos mecanismos de dormência.
  2. A desvantagem deste método é que ao abrir a cápsula todas as sementes dela devem ser usadas ou eliminadas (algumas sementes maduras poderiam secar e ser armazenadas). Também se deve considerar que as sementes semeadas a partir de cápsulas que não amadureceram bastante poderiam germinar lentamente ou simplesmente não germinar.

  3. Semeadura a partir de sementes secas. Uma vez que a cápsula está aberta, as sementes deixam de ser estéreis e requerem um processo de esterilização. Geralmente, é usada uma solução de hypochlorito (cloro) de sódio, hypochlorito de cálcio ou peroxido de hidrogênio. As sementes são agitadas dentro da solução que também contém uma gota de detergente para " umedecer", então se enxágua com água destilada e se semeia nos meios preparados. A vantagem deste método é que as sementes podem ser coletadas, secadas ao ar, armazenado por vários meses no refrigerador e usado quando é necessário.

Deveria ser considerado que o que se semeia é determinado pela disposição de qualquer uma das duas formas de encontrar as sementes de acordo com a época que se coletam.

3.2.2 Semeadura a partir de cápsulas verdes

O método geral para semear sementes a partir de cápsulas verdes é o seguinte :

1. Com ajuda de um bisturi, remova a flor morta da cápsula cuidadosamente

2. Use uma escova de dente macia para esfregar a cápsula suavemente com a solução ensaboada.

3. Enxágüe a cápsula em água.

4. Introduza a cápsula aproximadamente durante 10 minutos em uma solução de hypochlorito de sódio a 1% ao qual foi acrescentada uma gota de detergente (levar em conta que o cloro comum é hypochlorito de sódio a 5% portanto é necessário diluir).

  1. Transfira a cápsula submersa na solução de cloro à câmara de fluxo laminar.

6. Tire a cápsula da solução de cloro usando uma pinça e levando preferivelmente do lado que cai o pecíolo. Então submirja em álcool a 100% e passe rapidamente pelo fogo (Flambar). Deixe que o álcool se queime completamente e que a cápsula e a pinça se esfriem. Repita o processo duas vezes para as cápsulas grandes. Para o caso das cápsulas pequenas e frágeis você decide com discrição o tempo de passar pela chama (talvez só uma vez).

Se não for possível sustentar pelo pecíolo, mude a posição da pinça antes de flambar novamente.

7. Transfira a cápsula a uma superfície desinfetada (como uma caixa esterilizada Petri).

Corte a cápsula longitudinalmente ao meio com ajuda de um bisturi desinfetado.

Use uma folha de bisturi nova para cada cápsula prevenir a propagação de vírus.

8. Erga uma metade da cápsula com a pinça e bata ligeiramente no meio para espalhar as sementes.

9. Repetir este passo até que todas as sementes são usadas. As sementes menos maduras podem ser retiradas da cápsula com a pinça.

10. Normalmente são somadas algumas gotas de água em cada frasco de modo que certos grupos de sementes se separem e se distribuam no ágar.

3.2.3 Semeadura a partir de capsulas dehiscentes (aberto com sementes secas)

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Métodos diferentes existem para o semeadura a partir de sementes secas. Todos eles se baseiam na esterilização das sementes e lavagem em água destilada antes dos semear, mas as técnicas variam.

O tempo de esterilização também varia, dependendo das espécies, do tempo de maturação logo que a semente é coletada, das condições climáticas do momento da coleta e dos métodos de secar e armazenamento. Por isto, uma gama de tempos de esterilização é recomendado para as sementes novas.

O programa de conservação em O Pahuma usa duas técnicas principalmente para semear sementes maduras: o método da seringa e o método do pacote (ou saco de papel).

É possível usar outras técnicas, como a filtração, método que usa o funil de Buchner, mas eles não são incluídos neste manual.

Tanto para o método da seringa como para o método do pacote é aconselhável esterilizar os instrumentos e a água necessária previamente 1 dia, já que a água demora bastante para esfriar-se depois do autoclave.

Em geral, a técnica da seringa é usada para a maioria das sementes enquanto a técnica do pacote é usada para sementes mais raras e menores.

3.2.3.1 Método da Seringa

  1. Pegue uma seringa de 5 ml, tape a ponta da seringa com um pedaço de algodão envolto em um pedaço de meia de nylon (veja o diagrama), insira o embolo novamente e autoclave.
  2. Ao mesmo tempo, autoclave uma certa quantidade de água destilada (em frascos ou garrafas) e as pinças.

  3. Tire o embolo da seringa e coloque uma quantidade pequena de sementes na seringa.
  4. (Uma grande quantidade de sementes formará uma massa em forma de pasta se você usa a técnica 5b para o semeadura, ficando difícil a semeadura apropriada). Insira o embolo novamente.

  5. Absorver com a seringa 4 ml da solução de cloro a 1% (a que foi adicionado uma gota de detergente).
  6. Agite a seringa durante 5 minutos (ou outro tempo de esterilização), tenha certeza que as sementes estão completamente molhadas dentro da solução e que não estão em bolsas de ar. Expulse esta solução e absorva outra porção de solução fresca novamente. Agite durante outras 5 minutos e a expulse novamente.

  7. Lave as sementes 3-4 vezes absorvendo água destilada e esterilizada na seringa, agitando por um momento e logo expelindo o líquido.
  8. Semeie as sementes assim: a) esterilizando o colo da seringa, vertendo as sementes nos meios e eliminando o excesso de água ou

b) expelindo todo excesso de água, tirando fora o algodão com uma pinça e colocando as sementes sobre os meios.

3.2.3.2 método do Pacote (ou saco de papel)

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1. Elabore um pacote a partir de um pedaço de papel (veja o diagrama)

2. Esparrame uma quantidade pequena de sementes dentro dos pacotes. Novamente, quantidades grandes de sementes causará ajuntamento das sementes e impedem a penetração do cloro.

  1. Dobre e marque os pacotes usando grampos. Submirja em água destilada por de 5-10 minutos, apertando suavemente para dispersar qualquer bolsa de ar.

4. Com ajuda de pinça, transfira os pacotes à solução de cloro a 1% e que também contém uma gota de detergente. Deixe-os na solução durante 10 minutos (ou outro tempo de esterilização), agitando-os continuamente.

5. Transfira o pacote mais o cloro para a câmara de fluxo laminar.

Usando pinças transplante o pacote para água destilada (em um frasco). Agite.

Repita isto 3-4 vezes para enxaguar as sementes.

  1. Aperte os pacotes suavemente para eliminar o excesso de água e transferi-los para uma superfície esterilizada. Corte e abra o pacote usando tesoura desinfetada e semeie as sementes nos meios.

Normalmente, ao usar esta técnica se colocam os pacotes em um recipiente que contenha cloro e este sobre uma placa magnética. De acordo com a teoria, os grampos agirão como campos magnéticos e eles agitarão os pacotes automaticamente. Isto nunca funcionou em minha experiência pessoal. Freqüentemente agitando os pacotes os mesmos resultados são obtidos, e ao submergir ao mesmo tempo vários pacotes em cloro podem apressar o processo de semeadura.

3.3 Fechamento dos Frascos

Depois do semeadura os frascos podem se fechar usando "filme" ou papel cortado celofane das bolsas transparentes para assar. Se é usado "filme", o filme devera estar desenrolado na câmara de fluxo, dobrado um lado sobre o outro, e o mais próximo lado para a parte posterior da câmara é o que devera ser colocado nos frascos. Então, segura-se o filme com uma fita elástica e corta-se a sobra. Corta-se o papel celofane em quadrados, e se autoclava dentro dos frascos fechados antes de ser usado. O quadrado de celofane se retira dos frascos usando pinças, e se coloca no frasco que contém o meio e assegura ele usando uma fita elástica. Das bolsas transparentes assar KLAR 2000 a pessoa pode obter 20 quadrados por bolsa e 160 quadrados por pacote (8 bolsas por pacote).

O papel celofane é mais fácil de administrar que o filme e é reutilizável. Por tanto é recomendado para usar como material de cobertura.

3.4 Manutenção de registros

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Os registros devem ficar tanto em um caderno de laboratório e um sistema de cartões ou no computador. Os detalhes sobre os meios preparados, o processo de semeadura e as notas de observação devem registrar no caderno. No sistema de cartões se registram todo o semeio, nomeando um código para cada um, o mesmo que consiste no código das espécies (por exemplo TF = Trichopilia fragrans) mais o código de semeadura (por exemplo TF12 se é no décimo segundo semeio de Trichopilia). A data em que a semeadura foi feito é colocado no canto superior esquerdo do cartão, e abaixo da data o número de frascos, tipo de meio (e a data que se preparou se lembrar ), o código e fonte da semente e qualquer outra observação durante o processo de semeadura.

Os frascos são examinados semanalmente e se deve registrar qualquer contaminação e germinação com a data correspondente. Se um frasco é eliminado deve-se marcar em algum lugar visível com um X e deve-se registrar a causa (por exemplo, contaminação por fungos ou bactérias).

Se todos os frascos de um lote foram eliminados , deve ser apontado com um X ao lado do código da espécie e com um X grande no cartão inteiro. O cartão não devera ser descartado, pode ser útil mais tarde para analisar as causas do problema.

Cada frasco tem um rótulo com o código de semeadura e qualquer outra informação relevante e útil para te-la em um acesso fácil e não ter que recorrer aos cartões, como é o tempo de esterilização.

Cada frasco também está rotulado com um código simples no momento verter os meios, com o propósito de prevenir qualquer confusão durante o armazenamento ou a semeadura.

4. CUIDADO DAS PLÁNTULAS.

4.1 As sementes nos frascos.

As sementes no USFQ crescem 40 cm abaixo dos tubos fluorescentes de 20 watts em um quarto de crescimento que é regulado aos 18C com 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Os recentes frascos devem ser revisados regularmente depois da semeadura pelo risco de contaminação. Se a contaminação é descoberta mais cedo possível, pode-se combater antes que se disperse totalmente . Porém, uma vez que o fungo produziu esporos, ou se existe pouco líquido no fundo do frasco, não é aconselhável combater esta contaminação. Em casos como este, o frasco deve ser eliminado. De um modo ocasional, uma contaminação de fungos poderiam motivar a germinação (Mónica de Navarro, conversação pessoal). Neste último caso, pode-se deixar que as sementes cresçam, mas devem ser transplantadas antes que o fungo ocupe seu espaço e as destrua (contatar com Mónica para conselhos).

Água destilada pode ser adicionada se os frascos estão secos, usando uma seringa desinfetada.

As plantas pequenas são transplantadas quando elas começarem a aparecer folhas e começam a encher o frasco. A exceção para esta regra se da quando for mais eficaz remover os protocornios de um frasco ou caixa Petri contaminada.

As plántulas são transferidas a frascos novos que contêm o meio usando pinças desinfetados.

Uma agulha de crochê é útil nesta fase para retirar sementes delicadas ( Mónica de Navarro, conversação pessoal). O meio seguinte pode ser o mesmo que o primeiro, mas é normalmente melhor se a pessoa acrescentar ao meio, substâncias complexas (como banana , leite de coco, suco de abacaxi ou vitamina B) fomentar o desenvolvimento da raiz (ver o Apêndice xx).

A pessoa pode fazer um buraco pequeno nas tampas (se eles são feitos de metal ou plástico, possivelmente no celofane e não aconselhável no filme) e selando dois ou três vezes com o microporo para proporcionar uma superfície de respiração seguro a prova de esporos nas tampas.

Deve-se fazer alguns transplantes antes que as plantas estejam prontas.

4.2 Transplante

Nos frascos as plántulas foram desenvolvidos em uma atmosfera fechada e limpa e para que devera se acostumar gradualmente à atmosfera externa antes de ser transplantadas para as bandejas.

No quarto de crescimento, a luz é baixa e tanto a luz como a temperatura são praticamente constante.

A umidade nos frascos são altas e as plantas são protegidas de ataques de fungos, bactérias e herbívoros.

Nos meios naturais, temperatura e iluminação variam constantemente. As novas plantas devem ser protegidas de modo especial da luz solar forte: uma pequena quantidade de luz solar poderia queimar as folhas destas plantas até mesmo as que normalmente crescem na sombra. Também, o plántulas que cresceram em condições de alta umidade terá cutículas fracas e para isto, precise se acostumar gradualmente para meios mais secos antes de ser transplantadas. Finalmente, tanto na fase de aclimatação como no de transplante, as plántulas devem ser cuidadas diariamente para evitar problemas, e mais de uma vez ao dia se o clima é seco e ensolarado.

Na continuação se detalham alguns conselhos para o transplante. O tempo de duração de cada fase pode variar com respeito ao especificado: o constante monitorando deveria dar uma idéia da coisa mais apropriada para cada espécie debaixo de certas condições. Modifique estes passos quando for necessário.

  1. Se é possível a fase de transplante começar no inicio de um período chuvoso.
  2. Os baixos níveis de luz e a umidade alta por este tempo ajudaria que as sementes se aclimatassem e se estabilizassem. (Porém é necessário considerar que um alto teor de umidade poderia fomentar um ataque de fungos quando é plantado neste tempo) Coloque os frascos num lugar sombrio e protegido da chuva de forma que se aclimatem as novas condições de luz e temperatura. Os deixe de 2 a 4 semanas com as tampas.

  3. Solte o tampas para permitir a entrada de quantidades pequenas de ar. Deixe-as deste modo durante 1 semana. Revise diariamente se tem folhas murchas e que os meios estão úmidos mas não totalmente molhado.
  4. 4. Abra os frascos um pouco mais. Os deixe durante alguns poucos dias e revise diariamente.

  5. Abra as tampas até a metade da abertura. Os deixe deste modo por outros poucos dias e revise diariamente.

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6. Abra as tampas três quartos. Os deixe deste modo durante outros poucos dias e revise diariamente.

  1. Abra os frascos completamente. Se é possível mante-los abertos por uma semana antes

de levar as plántulas e transplanta-las no criador.

8. Escolha os meios corretos para plantar as plantas pequenas. (ver o Apêndice)

9. Cuidadosamente retire as plantas dos frascos, os separe suavemente e enxágüe os resíduos de ágar.

10. Encha uma bandeja (funda com buracos) com composto e submerge isto dentro uma grande fonte de água. Umedeça as raízes da planta com fungicida e plante em meios flutuantes.

11. Quando a bandeja é retirada da água, o meio deve aderir as raízes das orquídeas sem os destruir.

Coloque as novas plántulas na câmara de aclimatação ou em uma pequena carpa de mesa feita de plástico transparente para que assegure a alta umidade durante a fase de estabelecimento.

Rocear água ajudarão manter a umidade nas primeiras fases.

12. Novamente, aclimate as plántulas gradualmente aos novos meios (por exemplo carpa completamente marcada, porta da carpa parcialmente aberta, porta completamente aberta, remover a carpa mas proteger da chuva, remover a proteção da chuva; com certeza espécies deveria ser protegido todas as plantas provavelmente em baixo de um coberto com plástico) Quando eles já são aclimados e são suficientemente grandes, eles podem ser transplantadas a bandejas maiores ou simplesmente aderido ao tronco de uma árvore, ramo ou pedaço de cortiça (com ou sem um pouco de musgo experimental) Rocee água nas fases iniciais do desenvolvimento, julgue você quanta quantidade de água e quando colocar considerando que deve ser evitado que a planta seja ressecada , mas o crescimento de fungos não pode ser propiciado.

5. CONCLUSÃO

Por meio da germinação em vitro um número maior de plantas pode ser cultivado por um período de tempo relativamente menor (alguns meses para espécies mais rápidas). Um grupo destas sementes germinadas poderá ser exportado facilmente porque as orquídeas cultivadas e mantidas em frascos esterilizados estão isentas dos regulamentos habituais CITES relativo a sanidade vegetal e vida selvagem

Outro grupo de sementes pode ser enviado para o berçário de orquídeas da Reserva Orquideológica O Pahuma, plantadas em bandejas para venda ou para introdução na floresta da Reserva ou outras áreas.

Cada cápsula de orquídeas contém muitos milhares de sementes, o que significa que poderão admirar muitas plantas.

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6. BIBLIOGRAFIA

Arditti, J., 1982. Germinação de semente de orquídea e cultura de muda - A Manual. Em

J. Arditti (o Ed.) Biologia de orquídea: revisões e perspectivas II. Págs. 243-370.

Cornell Universidade Imprensa, Londres.

Pritchard, H.W. (o Ed.) 1989. Métodos modernos em conservação de orquídea: O papel de

fisiologia, ecologia e administração. Cambridge Universidade Imprensa, Cambridge.

Ramsay, M., 1989. Apontamentos não publicados sobre germinação de sementes de

orquídeas.

Seaton, PÁG., & Pritchard, H., 19xx. O dos e donts de armazenamento de semente de orquídea.

Xxxx. Thompson, P.A. 1980. Orquídeas de semente. HMSO, Londres. 17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

APÊNDICE 1

Equipamentos e materiais usados para a germinação de sementes na USFQ

Câmara de fluxo laminar

Autoclave

Quarto de crescimento (18C, 16 horas de luz, 8 horas de escuridão) Estantes com

abajures fluorescentes de 20 watts.

Garrafa de Pyrex de 1 litro

Frasco de Pyrex de 1 litro

Placa e barra magnética

Medidor de PH

NaOH e HCl para ajustar o pH

Água destilada

Meio Phytamax para o cultivo de orquídeas (P6668, Sigma Químico)

Sales Murashige e Skoolg (xxx)

Ágar-ágar (Sigma Químico)

Açúcar

Carvão ativado

Vitamina B Complexo

Pinça de vários tamanhos

2 bisturis com folhas disponíveis

Potes de vidro para o etanol

Frascos de vidro

Potes de plástico de 250 ml

Caixas Petri

Recipientes pequenos de vidro para as sementes

Tampas para frascos Avental de laboratório

Papel de alumínio Toalha pequena para mãos

Pacotes de papel Luvas de cozinha marrons

Fita adesiva Luvas de plástico descartáveis

Filme Pedaços de tela

Bolsas de assar (celofane) Papel de cozinha

Fitas elásticas

Microporo

Papel

Álcool anti-séptico (etanol a 70%)

Etanol a 100%

Roceador para o etanol

Marcadores indeléveis (preto)

Cloro

Seringas

Algodão

Meia nylon

Grampeador e grampos